Kit elisa (kit diamed elisa), một giải pháp hỗ trợ cho kỹ thuật ifat phát hiện các kháng thể sốt rét

Sau khi nhiễm bất kỳ một trong các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium nào, thì các kháng thể cũng được sản xuất trong hầu hết tất cả các ca mắc bệnh sau 1-2 tuần và kéo dài 3-6 tháng sau khi sạch ký sinh trùng.

Những kháng thể này có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc nhiều năm nếu bệnh nhân có tiền sử tái nhiễm với ký sinh trùng sốt rét. Tái nhiễm hoặc tái phát là nhân tố dẫn đến nồng độ kháng thể tăng cao và nhanh chóng. Tuy nhiên, ở bệnh nhân không có miễn dịch, mức độ kháng thể giảm nhanh hơn và có thể không phát hiện được sau 3-6 tháng.

Phát hiện kháng thể không thay thế cho xét nghiệm máu trong chẩn đoán và điều trị bệnh sốt rét cấp tính, chủ yếu nó được sử dụng trong việc sàng lọc máu của người cho máu nhằm tránh truyền mầm bệnh sốt rét. Ngày nay, nguy cơ đó vẫn còn cao do giao lưu rộng rãi giữa các khu vực có bệnh sốt rét. Sốt rét xảy ra khi đi du lịch đến các vùng nhiệt đới chủ yếu là do Plasmodium falciparum (60%) và Plasmodium vivax (24%).

Kháng thể chống sốt rét có thể được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên IFAT vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện kháng thể sốt rét trong huyết thanh. IFAT là một phương pháp đơn giản và có độ nhạy cao, nhưng nó tốn thời gian và gặp khó khăn trong việc tự động hóa. Nó đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật viên được đào tạo. Kết quả của IFAT bị chi phối bởi sự chuẩn hóa về thao tác và máy móc, dẫn đến sự mất hài hòa giữa các kết quả tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Ngoài ra, IFAT có tính đặc hiệu cao với kháng nguyên P. falcipurum nuôi cấy invitro dài ngày, đây cũng là một hạn chế nữa của kỹ thuật IFAT.

Một giải pháp thú vị nhằm khắc phục những hạn chế của IFAT, phương pháp ELISA, sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp đã cung cấp một kỹ thuật thay thế nhạy cảm hơn và thiết thực hơn IFAT.

Kit ELISA mới, kiểm tra kháng thể bệnh sốt rét (DiaMed, Thụy Sĩ) đã được đánh giá, kết hợp hòa tan kháng nguyên P. falciparum và kháng nguyên tái tổ hợp P. vivax và phát hiện cả IgG và IgM. Kit này được so sánh với phương pháp IFAT thường được sử dụng. Đầu tiên, độ nhạy của hai phương pháp được xác định với các mẫu từ các bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng của bệnh sốt rét. Sau đó, các đặc trưng của hai phương pháp được xác định bằng cách kiểm tra huyết thanh từ người hiến máu không tiếp xúc với bệnh sốt rét và các nhà tài trợ có nguy cơ mắc bệnh sốt rét.

Vật liệu:

+) Mẫu từ các bệnh nhân bị nhiễm Plasmodium

Trong 95 mẫu huyết thanh được sử dụng để so sánh hiệu suất của ELISA và IFAT. Có 76 bệnh nhân đã trở lại từ nước có sốt rét lưu hành và được chẩn đoán dương tính với P. falciparum (n = 66), P. vivax (n = 5), P. ovale (n = 2), P. malariae (n = 2 ), phối hợp P. falciparum và P. malariae(n = 1) bằng phương pháp truyền thống, soi dưới kính hiển vi. Những bệnh nhân này hoàn thành một bảng câu hỏi về khu vực đặc hữu đã đến thăm và được chia thành hai loại:

1. Bệnh nhân trở về từ chuyến đi đầu tiên của họ đến một khu vực sốt rét và được coi là có nhiễm trùng cấp 1 (n = 32).

2. Bệnh nhân đã đến thăm khu vực có sốt rét lưu hành, được coi là du khách thường xuyên của vùng nhiệt đới có sốt rét lưu hành và có thể tái nhiễm (n = 44). Những mẫu này được sử dụng để tính toán độ nhạy lâm sàng.

+) Các mẫu lấy từ người hiến máu

Huyết thanh từ các nhà tài trợ máu được thu thập tại Etablissement du Français Sang d'Alsace (EFS Alsace). Trên cơ sở của một bảng câu hỏi y tế, các nhà tài trợ đã được lựa chọn và phân loại: Nhóm "không tiếp xúc với sốt rét người hiến máu" (2152 huyết thanh) nếu họ không đi du lịch đến vùng sốt rét lưu hành trong ba năm qua, nhóm đã được sử dụng cho việc tính toán các đặc trưng lâm sàng; Và nhóm người hiến máu có nguy cơ mắc bệnh sốt rét" (923 huyết thanh) nếu họ đã trở về từ một khu vực đặc hữu sốt rét giữa bốn tháng cuối cùng đến ba năm, nhóm này đã được sử dụng để tính toán phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu.

Kiểm tra kháng thể bệnh sốt rét bằng kỹ thuật IFAT

IFAT đã được sử dụng như là phương pháp tham chiếu. Kháng nguyên P. falciparum chuẩn bị từ nuôi cấy invitro dài ngày được gắn vào lam huỳnh quang. Huyết thanh được pha loãng 1/30 và 1/60 trong PBS trước khi thử nghiệm. Mỗi mẫu với nồng độ pha loãng 1/30, lấy 10 µl nhỏ vào mỗi giếng trên lam huỳnh quang,sau đó lam được ủ trong 25 phút ở 37°C. Tiếp đó các lam được rửa hai lần bằng dung dịch PBS trong 10 phút. Sấy khô và nhỏ phức hợp kháng Ig của người, có gắn huỳnh quang (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Pháp) pha loãng 1/200 trong PBS có chứa Evans blue (0,1 g / L). Sau khi ủ ở 37 ° C trong 25 phút, lam được rửa sạch hai lần bằng dung dịch PBS trong 10 phút và sấy khô. Cuối cùng lam được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss) với ánh sáng tia cực tím và vật khính 40X. Mẫu pha loãng với nồng độ 1/30 được dùng để sàng lọc âm dương; Và mẫu ở nồng độ pha loãng 1/60 là những mẫu dương tính theo cách thức sàng lọc trên đưa vào để xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh, với các bước kỹ thuật tương tự trên.

Kiểm tra kháng thể bệnh sốt rét bằng kỹ thuật ELISA

Kỹ thuật xét nghiệm kháng thể sốt rét bằng kit DiaMed ELISA được dựa trên cơ sở bắt cặp giữa kháng thể chống Plasmodium xuất hiện trong một mẫu huyết thanh với kháng nguyên đã được cố định trên place 96 giếng. Các kháng nguyên là một hỗn hợp của chiết xuất P. falciparum và kháng nguyên tái tổ hợp của P. vivax (MSP1 và CSP). Thử nghiệm đã được thực hiện như sau:

Sử dụng chất đệm pha loãng, nhỏ vào mỗi giếng 125 µl, tiếp theo là 25µl huyết thanh thử nghiệm. Trên cùng một place, nhỏ 25µl chứng âm và chứng dương. Sau đó ủ trong 60 phút ở 37°C trước khi được rửa 5 lần. Làm ráo, tiếp đó kháng thể kháng IgM và IgG người được thêm vào từng giếng, mỗi giếng 100µl và các place được ủ trong 30 phút ở 37°C. Sau đó tiếp tục rửa 5 lần, làm ráo và thêm 100 ml dung dịch chất bắt màu vào mỗi giếng. Ủ place trong bóng tối trong vòng 15 phút ở 37°C. Cuối cùng, thêm 50µl axit sulfuric 0,5M vào từng giếng và đọc OD trong vòng 15 phút ở 450 nm, với bước sóng tham chiếu là 620 nm. Kết quả dương tính được xá định theo công thức:

Một phản ứng âm tương ứng với một chỉ số Ab < 0,8, một phản ứng dương thì có chỉ số Ab tối thiểu bằng 1,0;Và kết quả nghi ngờ khi chỉ số Ab trong khoảng 0,8 - 1,0. Các thử nghiệm không phân biệt giữa IgG và IgM, hoặc giữa các kháng thể đối với P. falciparum, P. vivax, P. ovale và P. malariae.

Kết quả

Trong các mẫu từ các bệnh nhân bị nhiễm Plasmodium, độ nhạy lâm sàng và độ đặc hiệu lâm sàng của DiaMed test kit ELISA là 84,2% và 99,6%; cao hơn so với kết quả thu được khi thực hiện kỹ thuật IFAT (70,5% và 84,2%). Sự tương quan giữa hai phương pháp là 0,76.

Trong 923 nhà tài trợ nguy cơ sốt rét độ nhạy của kỹ thuật ELISA là 40% và độ đặc hiệu 98,3%, biểu diễn bị suy yếu do một số lượng lớn các kết quả nghi ngờ không hòa hợp giữa kỹ thuật ELISA và IFAT. Có nhiều kết quả nghi ngờ thu được trong kỹ thuật IFAT hơn so với ELISA.

So sánh kết quả phản ứng của ELISA với IFAT, hiệu quả của ELISA là J= 0,84 cao hơn so với IFAT (J= 0,71). Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA là 93,1% và 96,7%. Sự tương quan giữa hai phương pháp đạt 0,97; và với độ tin cậy 0,64.

Những sự khác biệt trên có thể được giải thích do khả năng phát hiện trường hợp nhiễm P. vivax. Hiệu suất của kỹ thuật IFAT và ELISA khác nhau theo loài. Kỹ thuật ELISA nhạy cảm hơn gấp ba lần đối với nhiễm P. vivax (24 trường hợp, 75% cho ELISA và 25% cho IFAT). Cả hai phương pháp ELISA và IFAT không phát hiện được những trường hợp nhiễm bệnh sốt rét lần đầu. Xem xét các trường hợp được chẩn đoán ở Strasbourg, cả hai kỹ thuật IFAT và ELISA không phát hiện được 3 trường hợp nhiễm P. falciparum từ ba bệnh nhân không có miễn dịch, được coi như các du khách lần đầu tiên, đã trở về từ Tây Phi ít hơn ba tháng trước (tương ứng ba ngày, 10 ngày và hai tuần). Đối với 9 trường hợp nhiễm P. vivax được chẩn đoán ở IPPTS, 3 trường hợp đã không được phát hiện bằng phương pháp ELISA và IFAT, 3 trường hợp chỉ phát hiện bởi kỹ thuật ELISA. Ba trường hợp không được phát hiện bởi cả ELISA và IFAT từ du khách lần đầu tiên đến vùng có sốt rét lưu hành và nhiễm P. vivax được chẩn đoán bằng kính hiển vi 2 tháng, 3 tháng và 12 tháng sau khi trở về châu Âu. Trong ba trường hợp còn lại nhiễm P. vivax, phát hiện bằng phương pháp ELISA và không được phát hiện bởi IFAT, tất cả cũng từ du khách lần đầu tiên đến vùng nhiệt đới có sốt rét lưu hành hơn ba tháng sau khi trở về từ Tây Phi (bốn, năm và 11 tháng). Đối với 19 trường hợp nhiễm P. vivax ở Venezuela, được coi như các cư dân địa phương, 3 trường hợp đã không phát hiện được bằng phương pháp ELISA và IFAT, 9 trường hợp chỉ được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA. Vậy có bất kỳ sự khác biệt nào hay không trong việc phát hiện kháng thể sốt rét giữa kỹ thuật IFAT và ELISA đã được giải đáp.

ThS. Hoàng Thị Mai Anh (lược dịch)

Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1819385