Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần, cơ cấu ký sinh trùng sốt rét

Kỹ thuật Nested PCR được áp dụng trong nghiên cứu này để xác định thành phần cơ cấu ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gây bệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnhBình Phước.

Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi đặc hiệu đối với từng loài Plasmodium. Kết quả phân tích 58 mẫu có KSTSR (+) tại xã Bù Gia Mập cho ta thấy có 4 loài KSTSR gây bệnh ở người, trong đó P. falciparum chiếm 60,9%; P. vivax chiếm 34,8%; P. malariae chiếm 2,9%; P. ovale chiếm 1,4%. Tỷ lệ nhiễm đơn P. falciparum chiếm 55,2%; nhiễm đơn P. vivax chiếm 24,1%; nhiễm đơn P. malariae chiếm 3,4%; nhiễm phối hợp 2 loài là 15,5%; nhiễm phối hợp 3 loài là 1,8%.

1/ ĐẶT VẤN ĐỀ:

Xác định chính xác từng loài KSTSR gây bệnh trên người là một khởi đầu quan trọng cho việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Một vấn đề mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là P. faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã làm biến dạng hình thái các chủng loại KST SR (Xét nghiệm kính hiển vi và sự nhầm chủng loại, Viện Sốt Rét KST-CT Trung Ương, 1965). Hiện nay đối với sốt rét, ngoài phương pháp nhuộm giemsa phát hiện KST SR còn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như: nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F …và đặc biệt là kỹ thuật PCR.

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật có độ nhạycao, có khả năng phát hiện được những trường hợp có nhiễm KST mật độ thấp (5-10 KST/ml máu), phát hiện được 4 loài KSTSR gây bệnh trên người hoặc nhiễm phối hợp 2 hay nhiều loài trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng mà kính hiển vi không thể phát hiện, phân biệt được đầy đủ và chính xác. Sự khác nhau về trình tự oligonucleotide của 4 loài cho phép thiết kế những đôi mồi đặc hiệu loài phù hợp cho kỹ thuật PCR.

Trong chương trình sàng lọc KST SR để điều trị tiệt căn, sự ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần cơ cấu KST SR tại những vùng sốt rét lưu hành nặng là khả thi trong tình hình sốt rét hiện nay.

Mục tiêu:
Xác định thành phần loài, cơ cấu và tỷ lệ nhiễm phối hợp KSTSR tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR.

2/ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:

2.1/ Địa điểm nghiên cứu:
Xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng. Trong 6 tháng đầu năm 2004 có tỷ lệ lam dương tính/lam soi là: 25,04%, tỷ lệ mắc /1.000 dân là: 32,89. Vì vậy chúng tôi chọn địa điểm này để tiến hành nghiên cứu.

2.2/ Đối tượng nghiên cứu: Tất cả những bệnh nhân đang sốt hay có sốt trong vòng 3 ngày trước đó.

2.3/ Thu thập mẫu:

2.3.1/ Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 6/2005 đến tháng 12/2005.

2.3.2/ Phương pháp thu thập mẫu:

Tiến hành 3 đợt thu thập mẫu trên 9 thôn của xã Bù Gia Mập: Bù Nga, Thôn 8, Bù La, Bù Dốt, Đắk Á, Bù Lên, Bù Lư, Bù Rên, Đắk Côn. Trong đó 494 người (theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp, ….) được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM (thể tích máu 30-50ml) để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt có đánh số thứ tự. Các mẫu này được mang về khoa SHPT của Viện phân tích bằng phương pháp PCR xác định thành phần KSTSR.

Tiến hành song song lấy lam máu xét nghiệm tại chỗ bằng kỹ thuật giemsa phục vụ điều trị.

2.3.3/ Phương pháp tách tinh khiết DNA:

Áp dụng phương pháp Kain K.C, Lannar và cộng sự (1995) tách tinh khiết DNA bằng Chelex100 .

2.3.4/ Phản ứng PCR : (Viện Sốt Rét KST_CT Trung Ương).
Vật liệu:
- Hóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng Sigma
- Hoá chất dùng cho phản ứng PCR :
+ dATP , dTTP , dCTP , dGTP (Abgene)
+ Tag polymerase ( Abgene )
+ Primer ( mồi ) : PLU5, PLU6 (Poligo ) , FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma )

- Lam kính, thuốc nhuộm giêmsa
- Giấy thấm Whatman 3MM Nested 1 : Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium. Mồi sử dụnglà Plu5, Plu6
- Trình tự mồi : Plu55’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’
- Plu65’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’
- Điều kiện phản ứng : 95 C – 5 phút(1 chu kỳ) 94oC – 1 phút, 58oC – 2 phút, 72oC – 2 phút(25 chu kỳ), 72oC – 8 phút(1 chu kỳ)
- Nested 2 : Phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài .

Trình tự mồi :
- FAL15’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3’
- FAL25’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3’
- VIV15’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3’
- VIV25’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3’
- MAL1 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3’
- MAL2 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3’
- OVA15’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3’
- OVA2 5’-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3’

Thành phần phản ứng như Nested 1, chỉ khác DNA khuôn được lấy từ sản phẩm của Nested 1. Điều kiện phản ứng như Nested 1, chỉ khác từ bước 2 đến bước 4 được lặp lại 30 chu kỳ.

2.3.5/ Phương pháp phân tích kết quả:

Sản phẩm PCR được phân tích kết quả bằng kỹ thuật chạy điện li trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromide. Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu từng loài như bảng1.

3/ KẾT QUẢ:

Tổng số mẫu thu thập được từ xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước là 494 mẫu. Số mẫu phân tích bằng kỹ thuật Nested PCR là 494 mẫu. Kết quả có 58 mẫu (+). Thành phần cơ cấu vàtỉ lệ nhiễm phối hợp KST (xem bảng 2). Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của những bệnh nhân nhiễm đơn P. falciparum, nhiễm đơn P. vivax, nhiễm đơn P. malarie, nhiễm phối hợp 2 loài, nhiễm phối hợp 3 loài được biểu hiện trên các hình 1, 2, 3, 4. Dựa vào Bảng 1, ta thấy trên hình ảnh điện di kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu cho từng loài Plasmodium.

4/ BÀN LUẬN:

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR và kỹ thuật Giemsa đều phát hiện những trường hợp có KST SR như nhau (58 ca).

Kỹ thuật PCR phát hiện nhiều ca nhiễm phối hợp hơn là Giemsa (10 ca so với 5 ca). Nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,166). Có 1 ca kết quả giemsa là P.vivax nhưng Nested PCR là P.malarie. Còn lại 5 ca là thiếu loài trong nhiễm phối hợp (Bảng 4). Những trường hợp này mật độ KST SR trên lam rất thấp (+).

Phương pháp PCR có thể phát hiện KST SR ở mật độ thấp đặc biệt là trong những trường hợp nhiễm phối hợp 2 hoặc 3 loại. Theo công trình nghiên cứu “Áp dụng các kỹ thuật SHPT để nghiên cứu thành phần cơ cấu loài của KSTSR tại tỉnh Quảng Bình 2004-2005” của Lê Đức Đào và cộng sự cho thấy so với kỹ thuật nhuộm Giemsa, kỹ thuật PCR phát hiện được tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn (30% so với 4,6%).

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật có tính chính xác cao nhưng chi phí tốn kém, rất khó thực hiện ở thực địa vì thế phương pháp Giemsa vẫn là kỹ thuật thường quy trong chẩn đoán KST SR hiện nay.

5/ KẾT LUẬN:

P. falciparum chiếm tỷ lệ cao (60,9%) trong cơ cấu KST SR qua PCR và Giemsa. Kế đến là P. vivax (34,8%).

PCR phát hiện được nhiễm phối hợp nhiều hơn là Giemsa (10 ca so với 5 ca).

Qua PCR có sự hiện diện của P. ovale tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước.

Kỹ thuật PCR chính xác vàđòi hỏi mức độ chuyên hóa cao về trang thiết bị, hoá chất, kỹ thuật viên thực hiện. Tuy nhiên,kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ kỹ thuật xác định loài KST SR đang được sử dụng thường quy là kỹ thuật Giemsa, đặc biệt là trong những trường hợp nhiễm KST SR ở mật độ thấp.

Ma Minh Hieu, Pham Giang Anh, Nguyen Thi Kim Lien, Pham Xuan Đinh