Liên hệ | English

Các vấn đề thường gặp trong kỹ thuật ELISA

Hiện nay, kỹ thuật ELISA được xem có độ nhay cao trong chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng đường ruột. Tuy nhiên trong quá trình thực hiện cũng có thể xảy ra rất nhiều vấn đề như những gì xảy ra ở hầu hết các xét nghiệm miễn dịch. Bài viết sẽ cung cấp cách xử lý một số sự cố thường gặp trong quá trình thực hiện thí nghiệm.

1. Trường hợp độ đọc của mẫu nằm ngoài phạm vi giới hạn

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Mẫu không chứa hoặc chứa lượng chất cần phát hiện

Nếu lượng mẫu ít dưới mức phát hiện thì có thể tăng lượng mẫu

Mẫu chứa nồng độ chất cần phát hiện cao hơn ngưỡng tiêu chuẩn

Cần pha loãng mẫu và mẫu cần được phân tích lại

2. Trường hợp phản ứng không lên màu

Đôi khi không có sự phát màu (không có tín hiệu) trong phản ứng ELISA, đa số các trường hợp này là do bất cẩn. Khi đó chỉ cần kiểm tra hoặc xem xét lại từng bước để khắc phục các sự cố không cần thiết

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Thuốc thử bị sử dụng sai thứ tự hoặc một bước thí nghiệm nào đó đã bị bỏ qua

Kiểm tra lại các bước trong quy trình và lặp lại thí nghiệm

Sử dụng không đúng chất cộng hợp (Conjugated)

+ Mỗi chất cộng hợp là đặc hiệu cho mỗi bộ kit do đó cần phải sử dụng đúng loại

+ Không chuẩn bị các dung dịch quá xa thời điểm làm thí nghiệm

+ Nếu dung dịch cộng hợp cần phải pha loãng thì phải lấy đủ dùng và sử dụng ngay. Không sử dụng lại phần thừa cho ngày hôm sau

Thiếu bổ sung cơ chất (Substrate)

Bổ sung cơ chất và tiếp tục thí nghiệm

Không đủ kháng thể hoặc không phát hiện được

Bổ sung thêm kháng thể và tiếp tục thí nghiệm

3. Tín hiệu nền cao

Tín hiệu nền cao trong phản ứng ELISA thường biểu hiện ở sự hiện màu quá mức hoặc chỉ số OD cao. Tuy nhiên trong một số trường hợp sự hiện màu và độ đọc OD không cao. Vấn đề này có thể là do không chú ý trong quá trình rửa dẫn đến một số lỗi

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Dùng nước không đảm bảo trong quá trình pha dung dịch rửa hay sử dụng để rửa mẫu

Dùng nước cất để pha dung dịch rửa hoặc để rửa giếng

Rửa không đúng khuyến cáo của nhà sản xuất

+ Cố gắng sử dụng số lần rửa cao nhất được khuyến cáo cho thí nghiệm

+ Nếu sử dụng máy rửa thì đảm bảo ít nhất 400 µl dung dịch rửa có trong mỗi đĩa trong mỗi lần rửa

Hệ thống rửa bị nhiễm vi sinh vật

Làm sạch hệ thống với dung dịch rửa trước khi sử dụng

Máy đọc bị trục trặc

Kiểm tra máy đọc

Nhiệt độ phòng thí nghiệm quá cao hoặc quá thấp

+ Duy trì nhiệt độ phòng từ 18 -250C.

+ Tránh thực hiện việc phân tích gần nguồn nhiệt hoặc trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời hoặc dưới lỗ thông hơi

Cơ chất (Substrate) bị hỏng

Đảm bảo cơ chất không bị thay đổi màu sắc trước khi thêm vào các đĩa

Chất phản ứng được trộn lẫn, bị nhiễm hoặc được chuẩn bị không đúng cách

Đảm bảo sử dụng đúng chất phản ứng, các dung dịch hoặc không xảy ra bất kỳ sự nhiễm nào

Các giếng của đĩa bị nhiễm

+ Tránh việc nhiễm chéo giữa các giếng bằng việc sử dụng tấm đậy phù hợp

+ Nếu sử dụng pipet đa kênh thì tránh không để chạm vào hóa chất trên đĩa

4. Độ đọc OD thấp

Trong kỹ thuật ELISA, có một số nguyên nhân dẫn đến độ đọc OD thấp và sự lên màu của các giếng trong điã thấp. Mục này sẽ nêu lên một số hướng giải quyết cho phù hợp như sau:

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Nhiệt độ phòng thí nghiệm quá thấp

Duy trì nhiệt độ phòng từ 18 -250C.

Tránh thực hiện việc phân tích dưới luồng t gió trực tiếp từ điều hòa

Dung dịch rửa được pha chưa đúng tỷ lệ hoặc sử dụng sai dung dịch rửa

Khuyến cáo sử dụng dung dịch rửa pha theo đúng tỷ lệ đã cho trong bộ kit. Ghi nhãn cho từng dung dịch rửa để tránh sử dụng nhầm

Hệ thống rửa nhiễm vi sinh vật

Làm sạch hệ thống rửa với dung dịch rửa trước khi sử dụng

Sử dụng chu trình rửa nhiều hơn số lần được quy định

Đảm bảo về số lần rửa theo như khuyến cáo. Sử dụng số lần rửa tối thiểu theo như khuyến cáo cho thí nghiệm

Không tuân thủ thời gian ủ, thời gian ủ quá ngắn

Cần tuân thủ thời gian ủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất bộ kit

Các chất phản ứng và các đĩa ở nhiệt độ quá lạnh

Khi thực hiện phân tích, phải đảm bảo nhiệt độ của các đĩa và hóa chất ở nhiệt độ phòng bằng cách để các thành phần trên ra khỏi tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi bắt đầu thí nghiệm

Sử dụng chất phản ứng hết hạn

Cần kiểm tra hạn sử dụng trước mỗi lần sử dụng

Sử dụng không đúng chất cộng hợp (Conjugated)

+ Mỗi chất cộng hợp là đặc hiệu cho mỗi bộ kit do đó cần phải sử dụng đúng loại

+ Không chuẩn bị các dung dịch quá xa thời điểm làm thí nghiệm

+ Nếu dung dịch cộng hợp không cần phải pha loãng thì phải lấy đủ dùng và sử dụng ngay. Không sử dụng lại phần thừa cho ngày hôm sau

Đọc sai bước sóng khi phân tích

Xác định đúng bước sóng cho phân tích và đọc lại

Các bộ kit bị chênh lệch điều kiện môi trường quá nhiều

+ Kiểm tra nhật ký sử dụng xem bộ kit đã được sử dụng bao nhiêu lần

+ Kiểm tra xem bộ kit có bị để ở ngoài nhiệt độ bảo quản quá lâu hay không

Các đĩa phân tích đã được sử dụng trước đó hoặc đã bị hư hỏng

+ Các đĩa đã qua sử dụng phải được loại bỏ để tránh nhầm lẫn

+ Đảm bảo các đĩa trong tủ lạnh được đóng kín và có gói hút ẩm để duy trì điều kiện ổn định

Không đủ lượng kháng nguyên trên bề mặt giếng

Sử dụng nhiều kháng nguyên hơn trong việc bao phủ bề mặt giếng

Không đủ lượng kháng thể

Tối ưu nồng độ kháng thể cho phân tích

5. Độ lặp lại kém

Một vấn đề thường gặp trong kỹ thuật ELISA là khả năng lập lại kém, khả năng lặp lại trong 1 đĩa 96 giếng hoặc khả năng lặp lại kém giữa các đĩa

Khả năng lặp lại kém trong 1 đĩa

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Thao tác thêm mẫu đối chứng và chất phản ứng vào đĩa phân tích mất quá nhiều thời gian

+ Sử dung pipet đa kênh để thêm hóa chất vào nhiều đĩa cùng 1 lúc

+ Phân bố mẫu đối chứng và mẫu bệnh phẩm vào đĩa với thời gian như nhau

Kháng thể không được phân chia đồng đều trong mẫu

+ Nếu mẫu để trong tủ đông hoặc tủ lạnh, đảm bảo rằng nó được trộn đều trước khi pha loãng

+ Mẫu đã được pha loãng cũng cần phải được trộn đều trước khi nhỏ vào giếng

Khả năng lặp lại kém giữa các đĩa

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Thời gian ủ không đồng nhất giữa các đĩa

Đảm bảo các đĩa có thời gian ủ như nhau

Quy trình rửa khác nhau giữa các đĩa

Đảm bảo số lần rửa giống nhau giữa các đĩa

Thao tác sử dụng pipet chưa tốt, pipet không được hiệu chuẩn định kỳ

Hiệu chuẩn pipet định kỳ để đảm bảo chính xác lượng mẫu cần dùng

Các hóa chất sử dụng được lấy từ các bộ kit khác nhau

Nếu sử dụng hai bộ kit khác nhau cùng 1 lúc, hãy quan sát nhãn được dán trên mỗi loại hóa chất đảm bảo cho các hóa chất có cùng mã lot được sử dụng cho các đĩa tương ứng

ThS. Đỗ Thị Phượng Linh

Tài liệu tham khảo:

http://www.elisa-antibody.com/

http://www.biomedia.vn

Sponsor links (Provided by VIEPortal.net - The web cloud services for enterprises)
Thiết kế web, Thiết kế website, Thiết kế website công ty, Dịch vụ thiết kế website, Dịch vụ thiết kế web tối ưu, Giải pháp portal cổng thông tin, Xây dựng website doanh nghiệp, Dịch vụ web bán hàng trực tuyến, Giải pháp thương mại điện tử, Phần mềm dịch vụ web, Phần mềm quản trị tác nghiệp nội bộ công ty,